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01
Introduction
生物反应器是用于微生物和细胞的体外培养，并通过生化反应或发酵过程获取产物的装置，是生物合成、生物发酵、生物制药领域中关键的设备之一。而平行生物反应器可同一系统控制多个单元，使其保持各项参数的高度一致性，是合成生物学产业化关键技术工艺设计方案重要的环节，其核心功能是高通量筛选（high-throughput screening）和工艺放大。
02
Application
Background
藻蓝素（Phycocyanobilin，PCB）天然存在于蓝藻光感应系统中，在光能的吸收和传递中起着至关重要的作用，在光遗传学的研究中被广泛应用。由于其具有亮丽的天蓝色，可以作为天然色素在食品饮料中呈色，安全健康，营养丰富，是FDA唯一批准的蓝色食品添加剂。PCB还具有抗氧化、消除自由基、修复细胞延缓衰老、保水抗冻的作用，广泛应用于化妆品领域。此外，作为一种安全的药物，口服PCB在体内可以转化为NADPH氧化酶的有效抑制剂，在治疗阿尔茨海默症方面表现出巨大潜力；PCB对冠状病毒主要蛋白酶的活性也具有潜在的抑制作用，有潜力应用于防治近年来爆发的新型冠状肺炎病毒。目前，PCB的获取方法主要采用高温甲醇分解法从螺旋藻中提取。该方法存在诸多问题：（1） 甲醇高温热解需要耗费大量的能量，造成能源浪费；（2） 螺旋藻中与PCB共存的其他色素，如叶绿素、叶黄素等一系列前体，对后期产物纯化有不利影响；（3）螺旋藻生长周期较长，限制了藻蓝素的生产效率和应用。因此，从天然藻类中提取高纯度的PCB是一项复杂且不经济的方法，而采用合成生物学的方法合成PCB具有降低成本、节约能源和提高纯度的优点，目前已有研究人员在5 L发酵罐实现了PCB世界最高水平合成。
Strategy
首先，通过比较选择了来源于T. elongatus的HO1和来源于Synechocystis sp的PcyA来合成PCB，在此基础上，确定了含有强诱导启动子(T7lac)的高拷贝数质粒(pRSFDuet-1)最适合表达这两种酶(图1，图2)。
▲图1 用于PCB合成的�？�。灰色区域包括参与ALA替代途径（C4或C5途径）的酶合成；红色区域包括参与血红素合成的酶和中间体；蓝色区域包括参与PCB合成的酶和辅酶因子。
Figure 1. Modules for PCB synthesis. The gray block includes the enzymes involved in the alternative pathways (C4 or C5 pathway) for ALA synthesis; the red block includes enzymes and intermediates involved in heme synthesis; the blue block includes enzymes and cofactors involved in PCB synthesis.
▲图2优化HO和PcyA的表达策略以合成藻蓝素。（a）从不同来源选择HO和PcyA；（b）HO1和PcyA表达的质�：推舳拥挠呕�。蓝色和深灰色条表示PCB和分别为OD600。
Figure 2. Optimize the expression strategy of HO and PcyA to synthesize phycocyanin. (a) Selection of HO and PcyA from different sources; (b) optimization of plasmids and promoters for HO1 and PcyA expression. The blue and dark-gray bars represent the concentrations of PCB and OD600, respectively.
此外，在中等拷贝数的pCDFDuet-1载体中，采用DNA支架以2:1的比例实现HO1和PcyA的有效组装(图3)。
▲图3通过DNA支架调节HO和PcyA比例促进藻蓝素合成
Figure 3. Regulation of HO and PcyA ratio by the DNA scaffold to improve PCB synthesis.
随后，通过直接补充血红素前体ALA和适度过表达血红素生物合成途径中的关键酶(HemB和HemH)，增加细胞内前体物质供应，促进PCB合成。由于催化血红素合成PCB的两步酶促反应都伴随着铁氧还蛋白（Fd）和Fd-NADP+还原酶（Fnr）的循环再生，研究人员通过表达nadK基因（编码NAD+激酶）来加速辅因子循环，进一步增强了PCB合成（图4）。
▲图4 PCB合成中的辅因子增强循环
Figure 4. Enhanced cycle of cofactors for PCB synthesis.
此外，研究人员还通过添加还原剂作为辅助，发现当培养基中加入维生素C或谷胱甘肽时，藻蓝素产量会得到提高，进一步优化了维生素C的添加量，发现添加5 g/L维生素C时，最适合PCB生产。
最后，分别在摇瓶和发酵罐水平对发酵条件进行优化（图5）。
▲图5在5L发酵罐中放大分批和补料分批发酵。（a）分批发酵；（b）600g补料分批发酵/L葡萄糖和8g/L MgSO4·7H2O；（c）通过添加600 g/L葡萄糖、8 g/L MgSO4·7H2O和200 mg/L FeSO4·7H2O进行补料分批发酵；（d）通过添加600 g/L葡萄糖、8 g/L MgSO4·7H2O、200 mg/L FeSO4·7H2O和5 g/L(NH4)2SO4进行补料分批发酵
Figure 5. Scale-up batch and fed-batch fermentation in a 5 L fermenter. (a) Batch fermentation; (b) fed-batch fermentation by feeding with 600 g/L glucose and 8 g/L MgSO4·7H2O; (c) fed-batch fermentation by feeding with 600 g/L glucose, 8 g/L MgSO4·7H2O, and 200 mg/L of FeSO4·7H2O; (d) fed-batch fermentation by feeding with 600 g/L glucose, 8 g/L MgSO4·7H2O, 200 mg/L of FeSO4·7H2O, and 5 g/L (NH4)2SO4
在摇瓶水平，在30℃条件下用0.8 mM IPTG诱导，采用含有200mg/L ALA、20 mg/L FeSO4·7H?O和5 g/L维生素C的MR培养基有利于提高PCB的产量。在发酵罐水平，采用pH-stat法进行补料分批发酵，添加600g/L葡萄糖、8g/L MgSO4·7H?O和200 mg/L FeSO4·7H?O，在发酵罐水平获得藻蓝素28.32 mg/L，是至今报道的最高产量。此研究为在大肠杆菌中合成藻蓝素或血红素衍生物及其他天然色素提供了策略。
03
Conclusion
提取耗能大、纯化复杂且原料获取周期长的藻蓝素通过生物合成的方法实现了目前发酵最高的产量，以大肠杆菌为工程菌成功构建PCB完整代谢通路，通过基因调控手段（过表达关键酶及相关酶上游基因等）和辅料添加来促进PCB的合成，再于生物反应器内对菌种进行放大培养并对培养条件进行优化，采取补料分批发酵的方法在5 L发酵罐水平获得了PCB的高产量合成。
合成生物学是从原料到菌种再到产品的全链条设计和优化，可以在改造和优化天然表达体系的同时，将动物源和植物源的代谢路径构建到微生物体系中，重新合成全新的人工生物体系，最终实现目标代谢物的异源表达，将原料以较高的速率最大限度地转化为产物。而平行生物反应器是合成生物学产业化关键技术工艺设计方案重要的环节，其核心功能是高通量筛选和工艺放大，研究目标菌种在较大培养体系下的生长行为，优化生长pH、补料速度、搅拌速度、诱导剂添加、通气量等培养条件，实时监测体系内溶氧、温度等生长参数，多个反应器同时控制，使发酵过程一致，发酵结果具有一致性与平行性。“新芝·主元”MPB平行生物反应器，针对不同培养需求设计开发了500 mL、1000 mL和2400 mL三款不同容积的发酵设备，单元模块数量可按需拓展，适用于菌种的发酵工艺优化、工艺固定的菌种高通量筛选、最适培养基筛选等方向，涉及基因工程、生物制药、酶工程、合成测序、代谢途径/ 网路及生物底盘的设计与改造等多个领域。平行生物反应器上下游行业广泛，是研究合成生物学的得力助手，如有兴趣，期待您的咨询。
图源：DOI: 10.1021/acssynbio.2c00016
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